Evidence for in vivo resistance against allopurinol in a dog infected with Leishmania infantum by reduction in copy numbers of the S-adenosyl-methionine synthetase (METK) gene

I. Schäfer, M. Faucher, Y. Nachum-Biala, L. Ferrer, M. Carrasco, A. Kehl, E. Müller, T.J. Naucke, G. Baneth

Parasites & Vectors volume 17, Article number: 506 (2024)

Abstract

Background: In Europe, canine leishmaniasis is commonly caused by Leishmania infantum. Allopurinol is the main drug for long-term management of the disease, and clinical relapses of L. infantum infection treated with this drug are described. Resistance to allopurinol has been demonstrated in-vitro, but there is only little knowledge on in vivo resistance in dogs.

Findings: A two-year-old female spayed Akita Inu that was adopted from a breeding facility near Nice in France was initially diagnosed with primary immune-mediated hemolytic anemia. Immunosuppressive treatment was initiated, and the dog was referred for a second opinion to the Clinique Veterinaire Alliance in France. PCR testing for L. infantum was performed out of EDTA blood and IFA as well as ELISA testing out of serum. Resistance to allopurinol was associated with chromosome and gene copy number (CN) variations including a decrease in the S-adenosylmethionine synthetase (METK) gene CN.Results

Results: The dog showed pale mucous membranes, fever (39.1 °C), and a relapse of the anemia. The diagnosis of leishmaniasis was based on the cytological finding of Leishmania amastigotes (bone marrow, spleen, liver), positive PCR testing, and positive IFAT serology. The dog was treated with allopurinol over a period of 1316 days and additionally received two cycles of Glucantime® (meglumine antimoniate), before samples were submitted to the LABOKLIN laboratory to test for resistance against allopurinol. The laboratory work-up revealed mild thrombocytopenia, mild hyperproteinemia with hyperglobulinemia, a marked elevation of the c-reactive protein, and decreased iron concentration. Serum protein electrophoresis showed a polyclonal peak in the gamma globulins. Serology was positive in both ELISA (21.5 LE) and IFAT (1:1024). Quantitative PCR testing of blood was positive with low numbers of Leishmania (10/ml blood) at the timepoint of suspicion for resistance. The urinary protein-to-creatinine ratio was markedly elevated (2.5) and xanthine crystalluria was detected. A CN level of below 3 is considered suspicious for resistance, as revealed in the described Akita Inu dog.

Conclusions: Relapse of L. infantum infection after applying allopurinol for 1316 days due to resistance was suspected clinically. Positive PCR testing, consistent hematological and biochemistry abnormalities, and reduction in the METK gene CN backed up the clinical suspicion of resistance. Dogs infected with allopurinol resistant strains of L. infantum may represent a great risk for infection of naïve dogs, cats, and humans.

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Die granulozytäre Anaplasmose des Pferdes: ein Fallbericht und die epidemiologische Situation mit Fokus auf Deutschland

C.W. Axt, A. Springer, A. Besse, T.J. Naucke, E. Müller, C. Strube, I. Schäfer

Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere 2024; 52: 352–360

Zusammenfassung: Die equine granulozytäre Anaplasmose (EGA) ist eine zecken-übertragene Infektionserkrankung und wird durch den Erreger Anaplasma (A.) phagocytophilum ausgelöst. Als Vektoren gelten Zecken des sogenannten Ixodes (I.) ricinus/I. persulcatus-Komplexes in Zentral-, Nord-, West- und Osteuropa, in Deutschland überwiegend der Gemeine Holzbock, I. ricinus. Die Frühjahrs- und Sommermonate, insbesondere April bis Juli, stellen die Hochphase der Aktivität von I. ricinus in Zentraleuropa dar.Aufgrund der Veränderung klimatischer Bedingungen besteht mittlerweile ganzjährig das Risiko einer Zeckenexposition und damit auch einer Infektion mit A. phagocytophilum. Der beschriebene klinische Fall unterstreicht die saisonale Hochphase des Infektionsrisikos mit Vorstellung des Pferdes im Juni. Die klinische Symptomatik ist mit Fieber häufig unspezifisch undeine Thrombozytopenie ist der bedeutendste hämatologische Befund. Zur Diagnosestellung einer Infektion bzw. eines Erregerkontaktes sind direkte und indirekte Nachweisverfahren verfügbar. Eine positive PCR bestätigt wie im dargestellten Falleine akute Infektion, positive Antikörperspiegel sprechen für einen Erregerkontakt in der (jüngeren) Vergangenheit. Einschlusskörperchen, sogenannte Morulae, können schnell undkostengünstig in Ausstrichen aus dem peripheren Blut nachgewiesen werden und finden sich bevorzugt in neutrophilen Granulozyten, seltener in eosinophilen Granulozyten. Die Mikroskopie weist jedoch eine geringere Sensitivität im Vergleichzur PCR-Diagnostik auf. Bei dem beschriebenen Pferd gelangder Nachweis von Morulae im EDTA-Blut trotz positiver PCR nicht. Intrazellulär wirksame Antibiotika wie z. B. Oxytetracyclinund/oder Doxycyclin gelten als Therapie der Wahl und führen wie im beschriebenen Fall meist zu einer schnellen klinischen Besserung an EGA erkrankter Pferde. Eine Therapiekontrollemittels PCR wird 5–8 Tage nach Abschluss der Behandlungempfohlen, um eine Elimination des Erregers zu bestätigen. Ob bzw. wie lange Antikörper gegen A. phagocytophilum möglicherweise protektiv gegenüber einer erneuten Infektion sein könnten, ist bisher unbekannt. In der Humanmedizin wird A. phagocytophilum in der nördlichen Hemisphäre als „emerginghuman pathogen“ mit steigender klinischer Bedeutung eingestuft.

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Die equine Piroplasmose: Fallberichte und epidemiologische Situation in Europa mit Fokus auf Deutschland

C.W. Axt, A. Springer, J. von Luckner, T.J. Naucke, E. Müller, C. Strube, I. Schäfer


Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere 2025; 53(01): 49-58

Zusammenfassung: Die equine Piroplasmose (EP) wird durch die Erreger Babesia (B.) caballi und Theileria (T.) equi ausgelöst und durch Schildzecken übertragen. Innerhalb Europas sind die Erreger vor allem in den Mittelmeerländern endemisch. Autochthone Infektionen können in Deutschland aufgrund einzelner Fallberichte über Infektionen ohne Auslandsaufenthalt und der geographischen Ausbreitung verschiedener Zeckenarten nicht mehr ausgeschlossen werden. Die beiden vorgestellten Fälle verdeutlichen das Risiko einer Infektion bei Auslandsreisen in endemische Regionen sowie beim Import von Pferden aus endemischen Regionen nach Deutschland. Die klinischen Symptome sind oft unspezifisch, vor allem treten Fieber, Ikterus, Lethargie, Inappetenz, Gewichtsverlust und Leistungsminderung auf. Hämatologisch sind Anämien typisch. Auch Thrombozytopenien sind beschrieben. Die Schweregrade der Zytopenien variieren von gering- bis hochgradig. Zur Diagnosestellung einer Infektion bzw. eines Erregerkontaktes sind direkte (Polymerase-Kettenreaktion, Mikroskopie von Blutausstrichen) und indirekte Nachweisverfahren (Antikörpernachweis) verfügbar. Imidocarb-Dipropionat gilt als Mittel der Wahl zur Therapie der EP. Bei Infektionen mit B. caballi scheint eine Erregerelimination möglich, wohingegen Infektionen mit T. equi trotz Therapie oft in einem lebenslangen Trägerstatus resultieren. Die Prävention beschränkt sich auf die Kontrolle bzw. Vermeidung von Zeckenkontakt. Neben möglichen schwerwiegenden klinischen Auswirkungen hat die EP auch weltweit signifikante wirtschaftliche Folgen auf den Pferdehandel. Nach den Richtlinien der WOAH wird sie als meldepflichtige Erkrankung eingestuft und die Empfehlung ausgesprochen, jedes Pferd bei grenzüberschreitenden Reisen nach den jeweiligen nationalen Bestimmungen serologisch auf die EP zu testen. In Deutschland ist die Erkrankung aktuell weder melde- noch anzeigepflichtig.

Unexpected Cytological Detection of Leishmania infantum within the Secretion of a Canine Mammary Carcinoma

K. Törner, H. Aupperle-Lellbach, E. Müller, T.J. Naucke, I. Schäfer

Animals 2024, 14(19), 2794

Simple Summary:  A dog imported from Greece to Germany presented a mass in the mammary gland. Cytology of the secretion was performed, and besides the malignant epithelial cells, amastigotes of Leishmania (L.). infantum were identified. Diagnoses of mammary carcinoma and canine leishmaniasis were confirmed by histopathology, PCR testing, and serology. The detection of L. infantum amastigotes in the mammary glands indicates a possible shedding by the milk and makes trans-mammary transmission to puppies theoretically possible as another route of L. infantum transmission apart from vectorial transmission by sand flies, blood transfusion, vertical transmission, and venereal transmission.

Abstract: Mammary tumors are one of the most common neoplasms in female dogs, and cytology represents a non-invasive diagnostic method. The protozoal pathogen Leishmania spp. was previously demonstrated in canine mammary glands. An eight-year-old, female-spayed Doberman was imported from Crete, Greece, three years before the first presentation. The dog was presented due to a mammary tumor two years after adoption. The clinical examination revealed fever and weight loss. Smears of the mammary secretion were investigated cytologically. Multiple atypical epithelial cells with moderate to marked criteria of malignancy were detected. Furthermore, amastigotes were visible intra- and extracellularly. The diagnosis of L. infantum infection was based on a positive PCR out of the cytological smear, and a positive serology. Mammary carcinoma and granulomatous inflammation with amastigotes were confirmed by histopathology. We aimed to provide a complete report of cytological, histopathological, hematological, and biochemistry findings in a dog with L. infantum in the mammary glands with focus on trans-mammary pathogen transmission as a potential alternative way of spreading Leishmania infections. Canine leishmaniasis should be a potential differential diagnosis in dogs with lesions and/or inflammation in the mammary glands and a history of presence in areas endemic for L. infantum, especially the Mediterranean in Europe.

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Molecular and Serological Detection of Vector-Borne Pathogens Responsible for Equine Piroplasmosis in Europe between 2008 and 2021

C.W. Axt, A. Springer, C. Strube, C. Jung, T.J. Naucke, E. Müller, I. Schäfer

Microorganisms 2024, 12(4), 816

Abstract: Equine piroplasmosis (EP) is caused by Theileria (T.) equi and/or Babesia (B.) caballi. The aim was to assess the percentage of positive test results for EP in horses in Europe and to identify risk factors for pathogen contact/infection. This study included results from PCR and competitive enzyme-linked immunosorbent assay testing requested by European veterinarians between 2008 and 2021. Binary bivariate logistic regression was used to analyze risk factors. A total of 4060 horses were included. PCR testing was positive in 9.7% (154/1589), serology for T. equi in 15.2% (393/2591) and for B. caballi in 6.8% (175/2578). The odds of positive serology increased by 6.8% (B. caballi, p = 0.008) and 9.5% (T. equi, p < 0.001) each year. Regionality had a statistically significant impact on PCR (Eastern p = 0.047/OR = 1.605; Southern p = 0.029/OR = 1.451; Central p = 0.007/OR = 0.617) and serological testing for T. equi (Southern p < 0.001/OR = 2.521; Central p < 0.001/OR = 0.537; Northern p = 0.003/OR = 0.462), as well as breeds on seroprevalence of B. caballi (heavy horses: p = 0.016/OR = 2.239) and T. equi (ponies: p = 0.007/OR = 0.340; warmbloods: p = 0.025/OR = 1.602). In conclusion, there was a significant geographical impact on the results of PCR and serology, consistent with known vector habitats. The rising numbers of horses tested serologically positive highlights the importance of surveillance.

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